Cesta vašeho vzorku od odběru po „otevření“ vaší DNA
V této části se dozvíte, jaká je cesta Vašeho vzorku od odběru až po konečné „rozluštění“ Vaší DNA. Díky nejmodernějším technologiím, které využíváme v naší molekulárně genetické laboratoři, je řada procesů plně automatizovaná. Tím se výrazně zvyšuje rychlost získání potřebných dat z Vaší DNA.
Celý proces se skládá z mnoha kroků, jež na sebe navazují a je zde současně v každém kroku kontrolní mechanismus, který má za úkol eliminaci možných chyb. Díky standardizaci všech částí celé analýzy je možné doručit výsledky požadovaného vyšetření v době , kterou pro každý typ vyšetření granatujeme.
Soubor pacientů určených k sekvenaci
Na začátku si v naší laboratoři určíme soubor pacientů určených k sekvenaci. Moderní přístroje neprovádějí analýzu a přidružené procesy po jednom vzorku, ale provádějí je hromadně.
Příprava DNA k analýze
Před provedením jakékoliv molekulární analýzy genomu je nezbytná izolace DNA.
- Čistota této DNA, tedy minimální přítomnost jiných typů molekul v izolátu, je klíčová pro používané analytické metody.
- Prvním krokem izolace je homogenizace tkáně a rozbití buněčných membrán, čímž jsou odhalena buněčná jádra, obsahující požadovanou DNA.
- Následuje odstranění nechtěného buněčného obsahu, a to buď chemicky, nebo fyzikálně.
- V dalším procesu je třeba buď vysrážet molekuly DNA vhodným alkoholovým rozpouštědlem, nebo je propustit přes „síťku“, na níž se zachytí pouze DNA, zatímco ostatní, kontaminující látky protečou.
Izolovaná DNA pacientů se poté připraví na požadovanou koncentraci.
Automatizovaná příprava DNA knihovny
Následně se provádí tzv. automatizovaná příprava DNA knihovny, což je vlastně proces fragmentace DNA.
Laicky si to můžeme představit jako rozstříhání dlouhých molekul DNA na kratší úseky požadované délky, úpravu konců vzniklých fragmentů a jejich přečištění pomocí magnetických kuliček.
Měření koncentrace připravené DNA knihovny
Abychom mohli s DNA dále pracovat, musíme si ověřit, zda máme DNA v dostatečné koncentraci a zda má většina vytvořených fragmentů DNA požadovanou velikost.
Následně se provede kontrola celé knihovny a tzv. poolování vzorků.
Poolování vzorků
Spojení celé knihovny DNA do jednoho poolu = soubor DNA všech pacientů určených k sekvenaci se spojí do jedné zkumavky.
Hybridizace
V této fázi dochází k zachycení požadovaných genomických oblastí pomocí sond nasedajících na fragmentovaný vzorek DNA. Dále dojde k přečištění hybridizované DNA knihovny na magnetických kuličkách.
Loadování hotové DNA knihovny do sekvenačních cartridgí
Poté dochází k přenosu hotové DNA knihovny ze zkumavky do sekvenační kazety, která se poté vloží do sekvenátoru.
Sekvenace
Následně již může být spuštěna samotná sekvenace pomocí sekvenátoru. Sekvenování je finálním klíčovým bodem celého procesu a slouží – jednoduše řečeno – k dešifrování genetického kódu, což znamená zjišťování primárního pořadí nukleotidových bází v molekule.
- Nejnovější sekvenační metodou, kterou využíváme i v naší laboratoři, je NGS sekvenování (Next Generation Sequencing), které umožňuje paralelní sekvenaci mnoha fragmentů DNA současně.
- Každý fragment je přečten a poté software sestaví celkovou sekvenci.
- Laicky si to lze představit tak, jako byste četli více knih najednou.
Vyhodnocení
Poté již probíhá vyhodnocení sekvenačních dat, díky kterým vidíme, zda daný gen nebo více genů, na které se zaměřujeme, nevykazují mutaci.